可見分光光度計通過測量溶液對特定波長光的吸收來確定溶液的濃度，是一種快速、可靠的分析方法。通過正確的操作、儀器校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，可以獲得高精度的測量結(jié)果。在科學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測、食品質(zhì)量控制等領(lǐng)域，分光光度計都發(fā)揮著重要作用。掌握其使用方法，對于提高實(shí)驗(yàn)室分析的準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要。
一、基本原理
朗伯-比爾定律是分光光度法的理論基礎(chǔ)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=εbc，其中：
-A為吸光度（無單位）
-ε為摩爾吸光系數(shù)（L·mol?¹·cm?¹）
-b為光程長度（cm，通常為比色皿的厚度）
-c為溶液濃度（mol/L）
當(dāng)ε和b已知且保持不變時，吸光度A與溶液濃度c成正比關(guān)系。通過測量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可測定未知濃度溶液的濃度。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1.儀器準(zhǔn)備
(1)接通分光光度計電源，預(yù)熱15-30分鐘，使儀器穩(wěn)定。
(2)根據(jù)待測物質(zhì)的最大吸收波長（可通過全波長掃描確定），設(shè)置儀器的工作波長。
(3)將裝有空白溶液（通常是溶劑）的比色皿放入樣品室，調(diào)零（即將空白溶液的吸光度設(shè)為0）。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
(1)配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（通常5-7個濃度點(diǎn)）。
(2)從低濃度到高濃度依次測量各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。
(3)以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（現(xiàn)代儀器通常可自動完成）。
3.樣品測定
(1)將待測溶液裝入干凈的比色皿中，注意不要有氣泡和指紋。
(2)放入樣品室，測量吸光度值。
(3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或儀器自動計算功能，得出樣品濃度。
4.數(shù)據(jù)處理
(1)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R²），一般要求R²>0.99。
(2)若樣品吸光度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需適當(dāng)稀釋后重新測定。
三、注意事項
1.比色皿使用：
-手持比色皿時應(yīng)接觸磨砂面，避免接觸透光面。
-不同比色皿間可能存在差異，測定時應(yīng)固定使用同一比色皿或進(jìn)行校正。
-使用后及時清洗，避免有色物質(zhì)殘留。
2.溶液要求：
-待測溶液應(yīng)澄清透明，如有懸浮物需過濾或離心。
-溶液濃度應(yīng)控制在吸光度0.2-0.8范圍內(nèi)（此范圍內(nèi)誤差最小）。
-強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或有機(jī)溶劑可能腐蝕比色皿，需謹(jǐn)慎使用。
3.儀器維護(hù)：
-定期校準(zhǔn)波長和吸光度準(zhǔn)確性。
-長時間不用時應(yīng)關(guān)閉電源，覆蓋防塵罩。
-避免震動和強(qiáng)光直射儀器。
四、常見問題及解決方法
1.吸光度不穩(wěn)定：
-檢查電源是否穩(wěn)定
-確認(rèn)比色皿外壁是否清潔干燥
-檢查樣品室門是否關(guān)閉
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差：
-檢查標(biāo)準(zhǔn)溶液配制是否準(zhǔn)確
-確認(rèn)是否選擇了正確的測定波長
-檢查溶液是否發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或降解
3.測定結(jié)果偏差大：
-重新校準(zhǔn)儀器
-檢查空白溶液是否合適
-確認(rèn)是否有干擾物質(zhì)存在
